Nota redacției: Acesta este un mijloc promițător de a opri atașarea proteinei spike la celulă și de a le elimina din organism. După cum mulți știu, tratamentul cu ARNm cauzează daune masive din cauza proteinelor spike care se atașează de celulele corpului. Acest studiu a fost publicat inițial pe PubMed Central, The National Library of Medicine.
Acest tratament sugerat este disponibil fără prescripție medicală în Statele Unite, ceea ce face ca acest lucru să fie și mai promițător. S-a demonstrat că soluția de dioxid de clor (sau oxid de gemeni) elimină, de asemenea, proteinele spike, dar folosește un mecanism diferit. După cum se menționează în Documentul nostru de soluții realizat de Dr. Joe Neusma, "Aceste tratamente pot fi utilizate în mod sinergic pentru a oferi o soluție mai puternică". Consultați documentul de soluții pentru mai multe detalii.
Combinația de bromelaină și acetilcisteină (BromAc) inactivează sinergic SARS-CoV-2
Autori:
Javed Akhter,1,2,† Grégory Quéromès,3,† Krishna Pillai,2,† Vahan Kepenekian,1,4,† Samina Badar,1,5 Ahmed H. Mekkawy,1,2,5 Emilie Frobert,3,6,‡ Sarah J. Valle,1,2,5,‡ și David L. Morris1,2,5,*‡
Kenneth Lundstrom, editor academic și Alaa A. A. Aljabali, editor academic
Rezumat
Infecția cu coronavirusul sindromului respirator acut sever (SARS-CoV-2) este cauza unei pandemii mondiale, în prezent cu opțiuni terapeutice limitate. Glicoproteina spike și proteina de înveliș a SARS-CoV-2, care conțin punți disulfidice pentru stabilizare, reprezintă o țintă atractivă, deoarece sunt esențiale pentru legarea la receptorul ACE2 în celulele gazdă prezente în mucoasa nazală. Bromelaina și acetilcisteina (BromAc) au o acțiune sinergică împotriva glicoproteinelor prin ruperea legăturilor glicozidice și a legăturilor disulfidice. Am căutat să determinăm efectul BromAc asupra proteinelor spike și de înveliș și potențialul său de a reduce infectivitatea în celulele gazdă. Proteinele recombinate ale vârfului și ale învelișului SARS-CoV-2 au fost distruse de BromAc. Legăturile disulfidice ale proteinelor de vârf și de înveliș au fost reduse de acetilcisteină. În cultura in vitro a virusului întreg, atât a mutanților de tip sălbatic, cât ș i a mutanților de tip spike, SARS-CoV-2 a demonstrat o inactivare dependentă de concentrație în urma tratamentului cu BromAc, dar nu ș i în urma utilizării unui singur agent. Testarea clinică prin administrare nazală la pacienții cu infecție timpurie cu SARS-CoV-2 este iminentă.
1. Introducere
Coronavirusul 2 al sindromului respirator acut sever 2 (SARS-CoV-2), care a apărut recent, este agentul cauzal al bolii coronavirus 2019 (COVID-19), care poate varia de la forme asimptomatice la forme severe și letale cu sindrom de răspuns inflamator sistemic. Până la 21 februarie 2021, au fost raportate peste 111 milioane de cazuri confirmate, cu o mortalitate generală estimată la 2,2% [1]. În prezent, există puțini agenți terapeutici care s-au dovedit a fi benefici în reducerea progresiei bolii în stadii incipiente și tardive [2]. Deși, din fericire, există numeroase vaccinuri candidate, este posibil ca disponibilitatea lor pe scară largă pentru vaccinare să nu fie imediată, durata protecției imunitare să fie limitată [3,4], iar eficacitatea vaccinurilor poate fi redusă de variantele noi ale SARS-CoV-2. Prin urmare, este încă necesară explorarea continuă a unor tratamente eficiente.
Din punct de vedere structural, SARS-CoV-2 conține proteine de vârf de suprafață, proteine de membrană și proteine de înveliș, precum și nucleoproteine interne care împachetează ARN-ul. Proteina spike este un complex glicoproteic homotrimeric cu roluri diferite realizate prin modificări conformaționale dinamice, bazate în parte pe legături disulfidice [5]. Aceasta permite infectarea celulelor-țintă prin legarea la receptorii enzimei umane de conversie a angiotensinei (ACE2), printre altele, ceea ce declanșează proteoliza de către serina proteazei transmembranare 2 (TMPRSS2), furina și, probabil, alte proteaze, ceea ce duce la fuziunea virionului și a membranei celulei gazdă [6,7].
Intrarea virusurilor în celulele mamiferelor, sau "internalizarea virusului", este un mecanism-cheie al infecției cu virusuri învelite și se bazează pe modificări conformaționale dinamice ale glicoproteinelor de suprafață ale acestora, și anume, așa cum sunt mediate de reducerea legăturilor disulfidice și reglementate de oxiordoreductazele și proteazele de la suprafața celulară [5,8,9,9,10,11]. S-a demonstrat că intrarea SARS-CoV-2 în celulele gazdă începe cu destabilizarea proteinei spike prin tranziție mecanică alosterică, care induce o schimbare conformațională de la starea închisă "down" la starea deschisă "up" a domeniului de legare a receptorului (RBD) al proteinei spike [12,13]. Modificările conformaționale ale RBD și legarea virusului sunt induse de TMPRSS2 sau de catepsina L, care declanșează tranziția de la starea de pre-fuziune la cea de post-fuziune [5,12,13]. Energia eliberată prin reducerea legăturii disulfidice crește flexibilitatea proteinei, care este maximă atunci când starea redusă este completă [8], permițând astfel fuziunea membranelor gazdă-virus, care altfel este imposibilă din cauza forțelor de hidratare repulsive prezente înainte de reducere [5].
Bromelaina este extrasă în principal din tulpina plantei de ananas (Ananas comosus) și conține o serie de enzime care îi conferă capacitatea de a hidroliza legăturile glicozidice din carbohidrații complecși [14]. Studii anterioare au indicat că bromelaina elimină proteinele spike și hemaglutinina virusului Semliki Forest, virusului Sindbis, coronavirusului gastrointestinal al șoarecilor, virusului encefalomielitei hemaglutinante și virusurilor gripale H1N1 [15,16]. Ca moleculă terapeutică, este utilizată pentru debridarea arsurilor. Acetilcisteina este un antioxidant puternic care este frecvent nebulizat în căile respiratorii pentru acumularea de mucus și este, de asemenea, utilizat ca agent hepatoprotector în supradozajul de paracetamol. Cel mai important în contextul actual, acetilcisteina reduce legăturile disulfidice [17]. Mai mult, asocierea proteinelor spike și a proteinei de înveliș prin motivele lor triple de cisteină respective justifică ipoteza impactului asupra stabilității virionului în urma întreruperii punților disulfură prin acțiunea acetilcisteinei [18]. Combinația dintre bromelaină și acetilcisteină (BromAc) prezintă un efect mucolitic sinergic care este utilizat în tratamentul tumorilor mucinoase [19,20] și ca chimiosensibilizator al mai multor medicamente anticancerigene [21]. Aceste acțiuni diferite se datorează capacității BromAc de a desface structurile moleculare ale glicoproteinelor complexe, permițând astfel legarea datorită afinității ridicate dintre RBD și ACE2.
Prin urmare, în studiul de față ne-am propus să determinăm dacă BromAc poate perturba integritatea proteinelor spike și de înveliș ale SARS-CoV-2 și, ulterior, să examinăm potențialul său de inactivare împotriva replicării in vitro a două tulpini virale, inclusiv una cu o alterare a situsului de clivaj S1/S2 al unui mutant spike.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale
Bromelaina API a fost produsă de Mucpharm Pty Ltd (Kogarah, Australia) sub formă de pulbere sterilă. Acetilcisteina a fost achiziționată de la Link Pharma (Cat# AUST R 170803; Warriewood, Australia). Proteina recombinantă SARS-COV-2 spike protein a fost obținută de la SinoBiological (Cat# 40589-V08B1; Beijing, China). Proteina recombinantă a învelișului a fost obținută de la MyBioSource (Cat# MBS8309649; San Diego, CA, SUA). Toți ceilalți reactivi au fost de la Sigma Aldrich (St. Louis, MO, SUA).
2.2. Electroforeza pe gel a spike-ului recombinant și a anvelopei
Proteinele de spike sau de înveliș au fost reconstituite în apă distilată sterilă în conformitate cu instrucțiunile producătorului, iar alicotele au fost congelate la -20 °C. Două micrograme ș i jumătate de proteină de spike sau de plic au fost incubate cu 50 sau 100 µg/mL de bromelaină, 20 mg/mL de acetilcisteină sau o combinație a ambelor în apă Milli-Q. Controlul nu conținea nici un medicament. Volumul total al reacției a fost de 15 µL pentru fiecare. După 30 de minute de incubare la 37 °C, în fiecare reacție s-au adăugat 5 µL de tampon de probă. Un total de 20 µL din fiecare reacție a fost electroforezat pe un SDS-PAGE (Cat# 456-1095; Bio-Rad Hercules, CA, SUA). Gelurile au fost colorate cu albastru Coomassie.
2.3. Detectarea spectrală UV a legăturilor disulfidice în proteinele din spike și din plic
Metoda lui Iyer și Klee pentru măsurarea vitezei de reducere a legăturilor disulfidice a fost utilizată pentru a detecta legăturile disulfidice în proteinele spike și înveliș [22]. Proteina de vârf recombinantă SARS-CoV-2 la o concentrație de 3,0 µg/mL în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (pH 7,0) care conține 1 mM de acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) a fost incubată cu 0, 10, 20, 40 și 50 µL de acetilcisteină (0. 5 M), agitat la 37 °C timp de 30 de minute, urmat de adăugarea echivalentă de ditiotreitol (DTT) (0,5 M) și agitat timp de încă 30 de minute la 37 °C. Proteina spike a fost incubată în paralel numai cu DTT (0,5 M), ca mai înainte, fără acetilcisteină, și a fost agitată la 37 °C timp de 30 de minute. Absorbția a fost apoi citită la 310 nm. Detectarea spectrală UV a legăturilor disulfidice în proteina de înveliș a fost realizată în mod similar.
2.4. Inactivarea virusului întreg SARS-CoV-2 cu BromAc
Respectând pe deplin orientările provizorii de biosecuritate ale Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) referitoare la boala coronavirusului, testele de inactivare a virusului întreg SARS-CoV-2 au fost efectuate cu o tulpină de tip sălbatic (WT) reprezentativă pentru virusurile europene care circulă devreme (număr de acces GISAID EPI_ISL_578176). O a doua tulpină SARS-CoV-2 (notată ∆S), raportată în urma supravegherii genomice de rutină în regiunea Auvergne-Rhône-Alpes din Franța, a fost adăugată la testele de inactivare datorită unei mutații rare în situsul de clivaj S1/S2 și a disponibilității culturii sale în laborator (număr de acces GISAID EPI_ISL_578177).
Aceste teste au fost efectuate cu concentrații crescânde de bromelaină singură (0, 25, 50, 100 și 250 µg/mL), acetilcisteină singură (20 mg/mL) și reacția încrucișată a diferitelor concentrații de bromelaină combinate cu o formulare constantă de acetilcisteină de 20 mg/mL, față de două diluții de culturi de virus la 105,5 și 104,5 TCID50/mL. După 1 h de expunere la medicament la 37 °C, toate condițiile, inclusiv controlul, au fost diluate de 100 de ori pentru a evita citotoxicitatea, inoculate în patru exemplare pe celule Vero confluente (CCL-81; ATCC©, Manassas, VA, SUA) și incubate timp de 5 zile la 36 °C cu 5% CO2. Celulele au fost menținute în mediu minim esențial Eagle (EMEM) cu 2% penicilină-streptomicină, 1% L-glutamină și 2% ser fetal bovin inactivat. Rezultatele au fost obținute prin observații zilnice la microscopul optic, un test de colorare a lizei celulare la punctul final și o reacție în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă (RT-PCR) a extractelor de ARN supranatural. Pe scurt, testul de colorare a lizei celulare la punctul final a constat în adăugarea colorantului Neutral Red (Merck KGaA, Darmstadt, Germania) la monostraturile de celule, incubarea la 37 °C timp de 45 de minute, spălarea cu PBS și adăugarea de etanol citrat înainte de măsurarea densității optice (OD) la 540 nm (Labsystems Multiskan Ascent Reader, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA). DO a fost direct proporțională cu celulele viabile, astfel încât o DO scăzută ar însemna o liză celulară importantă datorată replicării virusului. În plus, ARN din supranaturile din puțuri a fost extras cu ajutorul stației de lucru semiautomate eMAG® (bioMérieux, Lyon, FR), iar RT-PCR a fost efectuată pe un sistem QuantStudio™ 5 (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Foster City, CA, SUA). Valorile de reducere Log10 (LRV) ale replicării virale au fost calculate prin diferența dintre godeurile de tratament și cele de control pentru fiecare condiție împărțită la 3,3 (ca 1 log10 ≈ 3,3 PCR Praguri de ciclu (Ct)).
2.5. Cinetica replicării prin analiză celulară în timp real
Pentru a compara capacitatea de replicare in vitro a tulpinilor WT și ∆S SARS-CoV-2, cinetica de replicare a fost determinată prin măsurarea impedanței electrozilor senzorilor celulare microelectronice pe instrumentul xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (RTCA) DP (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, SUA). Celulele Vero au fost însămânțate la 20.000 de celule pe puț pe o placă E-Plate 16 (ACEA Biosciences, Inc., San Diego, CA, SUA) și incubate în aceleași condiții de mediu descrise anterior la 36 °C cu 5% CO2. După 24 de ore, izolatele de cultură SARS-CoV-2 au fost inoculate în triplu exemplar la o multiplicitate de infecție de 10-2. Infecțiile simulate au fost efectuate în patru exemplare. Datele de impedanță electronică (indice celular) au fost colectate în mod continuu la intervale de 15 minute timp de 6 zile. Analiza suprafeței sub curbă a indicelui celular normalizat, stabilit în momentul inoculării, a fost apoi calculată la intervale de 12 ore. La fiecare interval, viabilitatea celulară a fost determinată prin normalizarea față de controlul celular corespunzător. Testele de comparație multiplă Tukey au fost utilizate pentru a compara fiecare condiție pe GraphPad Prism (versiunea software 9.0; San Diego, CA, SUA).
3. Rezultate
3.1. Alterarea proteinelor SARS-CoV-2 Spike și Envelope Proteine
Tratamentul proteinei spike cu acetilcisteină singură nu a prezentat nicio alterare a proteinei, în timp ce concentrațiile de Bromelain la 50 și 100 µg/mL și BromAc la 50 și 100 µg/20 mg/mL au dus la alterarea proteinei (figura 1A). Tratamentul cu acetilcisteină pe proteina de înveliș nu a alterat proteina, în timp ce tratamentul cu Bromelain la 50 și 100 µg/mL și BromAc la 50 și 100 µg/20 mg/mL a dus, de asemenea, la o fragmentare aproape completă și, respectiv, completă (figura 1A).
Figura 1
(A) Bromelaina și acetilcisteina prezintă un efect sinergic asupra destabilizării vârfurilor și a proteinei de înveliș ale coronavirusului sindromului respirator acut sever (SARS-CoV-2). SDS-PAGE a subunităților S1 + S2 ale proteinei de vârf recombinante SARS-CoV-2 (150 kDa) și a proteinei de înveliș (25 kDa). Proteinele au fost tratate cu 20 mg/mL de acetilcisteină singură, 100 și 50 µg/mL de bromelaină singură și o combinație de 100 și 50 µg/20 mg/mL de BromAc. (B) Reducerea disulfidelor din proteina de vârf a SARS-CoV-2 recombinantă prin acetilcisteină. Testul diferențial între acetilcisteină (Ac) și ditiotreitol (DTT) pentru reducerea legăturilor disulfidice găsite pe proteina spike indică faptul că acetilcisteina reduce 42 % din legăturile disulfidice înainte de adăugarea de DTT. Legăturile rămase sunt reduse de DTT pentru a produce cromogenul detectat la 310 nm. (C) Reducerea disulfidelor proteinei de înveliș a SARS-CoV-2 recombinante de către acetilcisteină. Testul diferențial între acetilcisteină (Ac) și ditiotreitol (DTT) pentru reducerea legăturilor disulfidice găsite pe proteina de înveliș indică faptul că acetilcisteina reduce 40% din legături înainte de adăugarea de DTT.
3.2. 3.3.2. Detecția spectrală UV demonstrează alterarea legăturilor disulfidice în proteinele spike și învelișului
Reducerea comparativă a legăturilor disulfidice pe proteina spike între DTT singur și DTT cu acetilcisteină a demonstrat o diferență de 42 % (Figura 1B), pe baza pantei graficelor [0,002599/0,006171 (100) = 42 %]. Astfel, acetilcisteina a fost capabilă să reducă 58 % din legăturile disulfidice din probă, după care legăturile disulfidice rămase au fost reduse de DTT pentru a produce cromogenul care a fost monitorizat în spectre. În mod similar, testul diferențial dintre acetilcisteină și DTT pentru reducerea legăturilor disulfidice găsite în proteina de înveliș [0,007866/0,01293 (100) = 60%] indică faptul că acetilcisteina reduce 40% din legăturile disulfidice înainte de adăugarea de DTT (Figura 1C).
3.3. 3.3.3. Potențialul de inactivare in vitro a SARS-CoV-2 de către bromelaină, acetilcisteină și BromAc
Pentru ambele tulpini SARS-CoV-2 testate, controalele virusului netratat la 105,5 și 104,5 TCID50/mL au produs efecte citopatice (CPE) tipice și nu s-a observat citotoxicitate pentru niciuna dintre combinațiile de medicamente pe celulele Vero. Rezultatele optice ale CPE au fost invariabil confirmate prin colorarea celulelor Neutral Red la punctul final. În general, tratamentul cu bromelaină și acetilcisteină singure nu au prezentat nicio inhibiție virală, toate cu CPE comparabile cu cele din godeurile de control al virusului, în timp ce combinațiile BromAc au prezentat inactivarea virusului într-o manieră dependentă de concentrație (figura 2). Tratamentul pe titrări de virus de 104,5 TCID50/mL (figura 2B,D) a produs o inhibiție mai consistentă a CPE pentru cvadruplete decât pe titrări de virus de 105,5 TCID50/mL (figura 2A,C).
Figura 2
Testele de liză celulară au demonstrat potențialul de inactivare in vitro al combinației de acetilcisteină și bromelaină (BromAc) împotriva SARS-CoV-2. Viabilitatea celulară a fost măsurată prin colorarea celulelor cu Neutral Red, unde densitatea optică (OD) este direct proporțională cu celulele viabile. O DO scăzută ar însemna o liză celulară importantă datorată replicării virusului. Tulpina SARS-CoV-2 de tip sălbatic (WT) cu titru de 5,5 și 4,5 log10TCID50/mL (A și, respectiv, B) nu a prezentat nicio inhibiție a efectului citopatic (CPE) pentru tratamentul cu un singur agent, comparativ cu condiția de control a virusului de tratament simulat. Combinațiile BromAc au fost capabile să inhibe CPE, în comparație cu controalele celulare de infecție simulată. Tratamentul unei variante a proteinei spike a SARS-CoV-2 (∆S) cu o mutație la joncțiunea S1/S2 la titrări de 5,5 și 4,5 log10TCID50/mL (C și, respectiv, D) a arătat rezultate similare. Barele reprezintă media fiecărui cvadruplicat per condiție, ilustrată prin cercuri albe. A fost efectuată ANOVA ordinară cu o singură cale, utilizând controlul virusului de tratament simulat ca și condiție de control (**** p < 0,0001, *** p < 0,0005, ** p < 0,003 și * p < 0,05).
Pe baza liniilor directoare privind inactivarea virusului stabilite de OMS, un proces robust și fiabil de inactivare va fi capabil să reducă replicarea cu cel puțin 4 log [Valoarea de reducere Log10 (LRV) = (RT-PCR Ct tratament - RT-PCR Ct control)/3,3; ca 1 log10 ≈ 3,3 Ct]. Ca atare, s-a efectuat RT-PCR pe extractele de ARN pentru a măsura direct replicarea virusului. Pentru tulpina de tip sălbatic (WT) la 104,5 TCID50/mL, au fost observate succese LRV > 4 cu 1 din 4 godeuri, 2 din 4 godeuri, 3 din 4 godeuri și, respectiv, 4 din 4 godeuri pentru 25, 50, 100 și 250 µg/20 mg/mL BromAc (figura 3). Este demn de remarcat faptul că, la 105,5 TCID50/mL, LRV au fost ușor sub prag, în medie de 3,3, cu 3 din 4 godeuri și 2 din 4 godeuri pentru 100 și, respectiv, 250 µg/20 mg/mL BromAc (tabelul 1). Pentru mutantul proteinei spike (∆S) la 104,5 TCID50/mL, nu a fost observat niciun LRV > 4 cu succes pentru 25 µg/20 mg/mL BromAc, dar a fost observat în 4 din 4 godeuri pentru 50, 100 și 250 µg/20 mg/mL BromAc (figura 3). De remarcat că, la 105,5 TCID50/mL, LRV au fost ușor sub prag, în medie de 3,2, cu 1 din 4 godeuri, 2 din 4 godeuri și, respectiv, 4 din 4 godeuri pentru 50, 100 și 250 µg/20 mg/mL BromAc (tabelul 1). În general, inactivarea in vitro a capacității de replicare a ambelor tulpini SARS-CoV-2 a fost observată într-o manieră dependentă de doză, cel mai puternic demonstrată la 100 și 250 µg/20 mg/20 mg/mL de BromAc față de 104,5 TCID50/mL de virus.
4. Discuție
Combinația de bromelaină și acetilcisteină, BromAc, a inhibat sinergic infectivitatea a două tulpini SARS-CoV-2 cultivate pe celule Vero. Confirmarea proteinelor și proprietățile moleculare ale acestora depind de integritatea structurală și geometrică, care depind atât de legăturile peptidice, cât și de punțile disulfidice. Acetilcisteina, ca un bun agent reducător, tinde să reducă punțile disulfură și, prin urmare, să modifice proprietățile moleculare ale majorității proteinelor. Această proprietate a fost exploatată pe scară largă în dezvoltarea mai multor terapii (boli pulmonare obstructive cronice, boli alergice ale căilor respiratorii, fibroză chistică, pseudomixom peritoneu etc.) [20,23,24,24,25,26,27]. Mai recent, acetilcisteina a fost utilizată în dezvoltarea de terapii pentru infecții respiratorii, cum ar fi gripa și COVID-19 [28,29,30], unde integritatea proteinei spike este vitală pentru infecție [12,13]. Un mecanism de acțiune presupus ar putea fi desfășurarea glicoproteinei spike și reducerea legăturilor disulfidice ale acesteia.
Proteina spike a SARS-CoV-2 este piatra de temelie a legăturii virionului cu celulele gazdă și, prin urmare, reprezintă o țintă terapeutică ideală. O acțiune mecanică directă împotriva acestei proteine spike reprezintă o strategie de tratament diferită față de majoritatea medicamentelor antivirale existente, care împiedică intrarea virusului în celulele gazdă, mai degrabă decât să vizeze mașinăria de replicare. BromAc acționează ca un agent biochimic pentru a distruge glicoproteinele complexe. Competențele enzimatice multipotente ale bromelainei, dominate de capacitatea de a întrerupe legăturile glicozidice, completează în mod util puterea puternică a acetilcisteinei de a reduce legăturile disulfidice [17]. Analiza secvenței de aminoacizi a glicoproteinei spike a SARS-CoV-2 a identificat mai multe situsuri prestabilite în care BromAc ar putea acționa preferențial, cum ar fi situsul S2' bogat în legături disulfidice [31], împreună cu alte trei legături disulfidice în RBD [32]. În paralel, rolul scutului glicozidic de acoperire a spike-ului, care este predispus să fie îndepărtat de BromAc, a fost evidențiat ca element de stabilizare a tranzițiilor de conformație RBD, precum și ca mecanism de rezistență la răspunsul imunitar specific [5,33,34].
Celulele de mamifere prezintă la suprafața lor funcții reductive capabile să desființeze legăturile disulfidice, iar reglarea acestui echilibru tiol-disulfidic s-a dovedit a avea un impact asupra internalizării diferitelor tipuri de virusuri, inclusiv SARS-CoV-2 [8,35,36,36,37,38]. Atât ACE2, cât și proteinele spike posedă legături disulfidice. Atunci când toate legăturile disulfidice RBD ale proteinei spike au fost reduse la tioli, legarea receptorului ACE2 la proteina spike a devenit mai puțin favorabilă [8]. În mod interesant, reducerea legăturilor disulfidice ale ACE2 a indus, de asemenea, o scădere a legăturii [8]. Mai mult, alte rapoarte au sugerat că bromelaina singură ar putea inhiba infecția SARS-CoV-2 în celulele VeroE6 printr-o acțiune asupra legăturilor disulfidice [39,40]. Ca atare, pierderea infectivității SARS-CoV-2 observată după pretratarea cu BromAc ar putea fi corelată cu desfășurarea cumulativă a proteinelor spike și de înveliș, cu o reducere semnificativă a legăturilor disulfidice ale acestora de către acetilcisteină, demonstrată in vitro.
Este interesant faptul că un efect similar al BromAc a fost observat atât împotriva WT, cât și împotriva ∆S SARS-CoV-2. Principala diferență în ceea ce privește secvențele de aminoacizi dintre SARS-CoV-2 și SARS-CoV anterior este includerea unui situs de clivaj furin între domeniile S1 și S2 [41]. Acest situs distinct al proteinei spike și rolul său în spill-over-ul gazdei și în fitness-ul virusului este un subiect de mare dezbatere [41,42,43,44]. De remarcat, ∆S, care prezintă o mutație în acest nou situs de clivaj S1/S2 și care modifică motivul de clivaj, nu prezintă nicio diferență aparentă în ceea ce privește capacitatea de replicare în comparație cu tulpina WT. Sensibilitatea ușor crescută a ∆S la tratamentul cu BromAc nu se datorează, prin urmare, unei polarizări bazale a replicării, dar mutația ar putea fi probabil implicată în îmbunătățirea mecanismului de acțiune al BromAc. Aceste rezultate ar sugera totuși că, începând de la o doză de prag, BromAc ar putea fi potențial eficient asupra tulpinilor mutante cu spike. Acesta ar putea fi un avantaj clar pentru BromAc față de mecanismele imunologice specifice ale unei vaccinări specifice pentru spike [3,4].
Până în prezent, au fost testate diferite strategii de tratament, dar nicio moleculă nu a demonstrat un efect antiviral clar. În plus, având în vedere evoluția eterogenă a bolii la pacienții cu COVID-19, strategia de tratament ar trebui să combine mai multe mecanisme de acțiune și să fie adaptată la stadiul bolii. Astfel, reproiectarea tratamentului rămâne o strategie ideală împotriva COVID-19, în așteptarea unei acoperiri vaccinale suficiente la nivel mondial [45,46]. În special, dezvoltarea unui tratament timpuriu orientat spre nas, predispus să diminueze infectivitatea unui pacient și să prevină progresia spre forme pulmonare severe, este susținută de un raționament puternic. Hou et al. au demonstrat că primul loc de infecție este mucoasa nazofaringiană, cu deplasare secundară către plămâni prin aspirație [47]. Într-adevăr, modelul de infectare a celulelor tractului respirator a urmat expresia receptorului ACE2, scăzând de la tractul respirator superior la țesutul alveolar. Raportul pentru ACE2 a fost de cinci ori mai mare în nas decât în tractul respirator distal [40]. Au fost testate in vitro și alte tratamente de reprofilare ca antiseptic nazal, cum ar fi Povidona-Iodina, care a demonstrat activitate împotriva SARS-CoV-2 [48]. În studiul de față, am demonstrat potențialul terapeutic in vitro al BromAc împotriva SARS-CoV-2 cu o doză eficientă de prag la 100 µg/20 mg/mL. Deoarece modelele de siguranță pentru căile respiratorii animale la două specii nu au prezentat până în prezent nicio toxicitate (date nepublicate), scopul este de a testa administrarea nazală a medicamentului într-un studiu clinic de fază I (ACTRN12620000788976). Un astfel de tratament ar putea contribui la atenuarea infecțiilor ușoare și la prevenirea infectării persoanelor care intră în mod regulat în contact cu virusul, cum ar fi lucrătorii din domeniul sănătății.
Deși rezultatele noastre sunt încurajatoare, există o serie de aspecte care trebuie luate în considerare în ceea ce privește această demonstrație. Și anume, condițiile in vitro sunt fixe și ar putea fi diferite de cele in vivo. Orice reacție enzimatică este influențată de pH-ul mediului, și cu atât mai mult atunci când este vorba de reacții redox, cum ar fi reducerea legăturilor disulfidice [9]. pH-ul mucoasei nazale este, în termeni fiziologici, între 5,5 și 6,5 și crește în rinită la 7,2-8,3 [49]. Vârsta înaintată, des întâlnită în cazul infecțiilor simptomatice cu SARS-CoV-2, induce, de asemenea, o creștere a pH-ului mucoasei nazale [49]. O astfel de gamă de variație, în funcție de modificările induse în mod obișnuit de o infecție virală, poate pune la îndoială eficacitatea strategiei noastre de tratament. Alte experimente in vitro pentru a testa diverse condiții de pH sunt în curs de desfășurare, dar, în cele din urmă, numai studiile clinice vor putea evalua acest aspect. Experimentele noastre au fost conduse pe o linie celulară de rinichi de maimuță cunoscută ca fiind foarte permisivă la infectivitatea SARS-CoV-2. Cu ipoteza de mai sus privind întreruperea echilibrului tiol-disulfură de liză a proteinei S, eficacitatea BromAc asupra SARS-CoV-2 nu ar trebui să fie influențată de modelul proteazei membranare. Reproducerea acestui protocol experimental cu linia celulară epitelială pulmonară umană Calu-3 (ATCC® HTB-55™) ar permite abordarea acestor aspecte, deoarece intrarea virusului este dependentă de TMPRSS2 și independentă de pH, ca în epiteliul căilor respiratorii, în timp ce intrarea virusului în celulele Vero este dependentă de catepsina L și, prin urmare, de pH [50].
În general, rezultatele obținute în cadrul prezentului studiu, împreună cu studiile complementare privind proprietățile BromAc și caracterizarea SARS-CoV-2, relevă un indiciu puternic că BromAc poate fi dezvoltat într-un agent terapeutic eficient împotriva SARS-CoV-2.
5. Concluzii
În prezent, nu există un tratament terapeutic adecvat pentru SARS-CoV-2 în fază incipientă, menit să prevină progresia bolii. BromAc este în curs de dezvoltare clinică de către autori pentru cancerele mucinoase datorită capacității sale de a modifica structurile complexe ale glicoproteinei. A fost examinat potențialul BromAc asupra proteinelor de vârf și de înveliș ale SARS-CoV-2 stabilizate prin legături disulfidice și s-a constatat că acesta induce desfășurarea proteinelor recombinante de vârf și de înveliș prin reducerea punților stabilizatoare disulfidice. BromAc a arătat, de asemenea, un efect inhibitor asupra SARS-CoV-2 de tip sălbatic și mutant de tip "spike" prin inactivarea capacității de replicare a acestuia in vitro. Prin urmare, BromAc ar putea fi un agent terapeutic eficient pentru infecția timpurie cu SARS-CoV-2, în ciuda mutațiilor, și chiar ar putea avea potențial ca agent profilactic la persoanele cu risc ridicat de infecție.
Contribuții ale autorilor
Conceptualizare, J.A., K.P., S.J.V. și D.L.M.; metodologie, J.A., G.Q., K.P., S.B. și A.H.M.; validare, J.A., G.Q., K.P., V.K., S.B. și A.H.M.; investigare, J.A., G.Q., K.P., V.K., S.B. și A.H.M.; redactare - pregătirea proiectului original, G.Q., K.P., V.K., A.H.M., E.F. și S.J.V.; supervizare, D.L.M. și E.F.; administrarea proiectului, S.J.V.; obținerea de fonduri, S.J.V. și D.L.M. Toți autorii au citit și au fost de acord cu versiunea publicată a manuscrisului.
Finanțare
Această cercetare este finanțată parțial de Mucpharm Pty Ltd., Australia.
Declarație privind disponibilitatea datelor
Un preprint al acestui manuscris a fost arhivat pe www.biorxiv.org (accesat la 31 ianuarie 2021) datorită urgenței COVID-19.
Niciun comentariu:
Trimiteți un comentariu
Rețineți: Numai membrii acestui blog pot posta comentarii.